EXAMENUL MICROBIOLOGIC AL SPUTEI

SCOP SI DOMENIU DE APLICARE

Scopul acestei analize este de a determina in timpul cel mai scurt posibil, agentii etiologici ai infectiilor tractului respirator inferior si a face posibile interventii terapeutice rapide si eficiente asupra pacientilor. Intrucat nu exista un test unic de detectare a tuturor agentilor etiologici, procedura descrisa in cele de mai jos, reprezinta un complex de tehnici, examene si teste prin care se urmareste atingerea, intr-un grad cat mai ridicat , a scopului enuntat.

ACTIUNI PREGATITOARE

Recoltarea sputei si aspiratului traheo bronsic Examinarea sputei expectorate este materialul principal pentru determinarea cauzelor pneumoniiilor bacteriene. Secretiile tractului respirator inferior, pot fi contaminate cu secretiile tractului respirator superior, in special cu saliva, cand se folosesc tehnici de recoltare invazive. Din aceasta cauza, sputa este printre probele cel mai putin relevante primite pentru examinare prin culturi in laboratoarele de microbiologie, chiar daca ea reprezinta proba obisnuita si pentru a carei examinare se consuma mai mult timp si numeroase materiale.
Pentru a reduce cat mai mult posibil contaminarea cu saliva si / sau cu secretii nazale, sputa se recolteaza din expectoratia de dimineata, dupa o prealabila gargara cu ser fiziologic.
Sputa se recolteaza in recipiente sterile (cutii Petri, flacoane cu gatul larg ) si se trimite imediat la laborator, in nici un caz sa nu ajunga la laborator in mai mult de 2 ore.
In cazul ca pacientii nu produc sputa sau nu o pot elimina, clinicienii vor folosi metode alternative adecvate (aspiratii sau tampoane traheale sau bronhice).
La copiii mici incapabili sa produca sputa se vor recolta aspirate gastrice pentru detectarea bacililor acido- rezistenti. Daca aceste probe nu pot ajunge imediat la laborator, ele trebuie neutralizate.
Prelucrarea probelor Portiunile purulente din proba se pun intr-o alta cutie Petri si se spala cu 2 3 ml ser fiziologic.
In cazul sputei neomogene sau vascoase se recurge la fluidificarea ei care se poate realiza astfel:

• se introduce sputa intr-o cantitate mica de bulion si se agita cateva secunde sau amestecul se aspira si respinge de mai multe ori cu o seringa sterila;
• sputa se omogenizeaza intr-un balon cu perle, dupa amestecarea ei cu bulion (5-10 ml. sputa + 3-5 ml. bulion);
• sputa spalata cu ser fiziologic se introduce intr-o eprubeta sterila si se amesteca cu un volum egal dintr-o solutie proaspata 0,5 % de N-acetil- L-cisteina sterilizata prin autoclavare (20 minute la 1210C). Se agita usor. Fluidificarea se produce in cateva minute;
• fluidificare cu agenti chimici: amestecarea sputei in parti egale cu acetat de amil 1,5 %. Aceasta tehnica degradeaza celulele epiteliale si leucocitele facand frotiul inutilizabil pentru examenul citologic.

MODUL DE LUCRU

Examenul microscopic Examinarea directa a preparatelor native Examinarea preparatelor native directe se face in cazul unor paraziti si pentru Pneumocystis.
Elementele fungice se vizualieaza cu microscopul in contrast de faza cu 10% hidroxid de potasiu (KOH).
Pentru aceasta examinare, o picatura din proba prelucrata ca mai sus se depune pe o lama de sticla curata si se acopera cu o lamela. Acest preparat nativ se examineaza la microscop (oc.10, ob. 40 - 45)
Se noteaza formatiunile constatate.
Examinarea preparatelor ( frotiurilor ) colorate Din fiecare proba se executa 3 frotiuri care dupa fixare se coloreaza astfel:

• un frotiu cu metoda Gram pentru aprecierea florei Gram-pozitive si Gram-negative si stabilirea grupelor de calitate citologica a sputei sau aspiratului traheo- bronsic;
• un frotiu cu metoda Ziehl Neelsen pentru bacteriile acido rezistente;
• un frotiu cu metoda May - Grnwald Giemsa pentru citologie.

Examinarea frotiurilor consta din aprecierea frecventei germenilor, a caracterelor lor morfologice si tinctoriale si din stabilirea raportului intre elementele celulare . Este important de retinut ca in cazul pneumoniei cu Legionella, sputa poate fi putina si apoasa, cu rare sau absente celule gazda. Examinarea prin culturi Se insamanteaza portiuni purulente sau din materialul omogenizat sau fluidificat pe urmatoarele medii:

• geloza-sange GS. O strie de stafilococ auriu insamantata peste ariile de epuizare a probei permite, prin fenomenul de satelism, izolarea si identificarea in cultura primara a speciilor de Haemophilus;
• geloza chocolat;
• agar Mac Conkey si agar cu albastru de bromtimol si lactoza;
• geloza Sabourand pentru levuri;
• agar Chapman.

Pentru sputocultura cantitativa este necesara fluidificarea sputei care permite omogenizarea acesteia.
Din mediile mentionate mai sus minimum indinspensabil este geloza-sange. Aceasta permite izolarea majoritatii bacteriilor implicate in etiologia infectiilor tractusului respirator inferior.
Suprafata mediului turnat in cutii Petri se insamanteaza prin striere cu 0,01ml sputa. Perpendicular pe striile de sputa, se insamanteaza sub forma unei strii o ansa de Staphylococcus aureus. Prin fenomenul de satelism, in vecinatatea striei de S. aureus se vor dezvolta speciile de Haemophilus.
Geloza-sange chocolat favorizeaza dezvoltarea tulpinilor mai pretentioase de Haemophilus si este indispensabil izolarilor cantitative.
Izolarea hemofililor este favorizata in sectoarele cu agar cu sange chocolat pe suprafata caruia se plaseaza discuri cu 10 g, bacitracina, iar a pneumococilor, daca pe un sector cu agar cu sange se depune un disc cu 4 g optochin.
Utilizarea mediilor diferentiale lactozate (MacConkey, AABTL) este facultativa si urmareste izolarea bacteriilor gramnegative reperate microscopic.
Incubarea mediilor insamantate se face 18 24 ore la 37 grade Celsius .

CITIREA SI INTERPRETAREA REZULTATELOR

Examinarea frotiului colorat cu metoda Gram Triajul citologic de calitate al sputei Se examineaza frotiul cu o marire de 100x , in zone bine etalate, cu celulele dispuse in monostrat, determinand numarul mediu al celulelor inflamatorii (CI) si al celulelor malpighiene (CM) din 10 campuri. Pe aceasta baza sunt propuse trei criterii de triaj calitativ al sputelor pentru examenul bacteriologic prin culturi, si anume:

• Grupele de calitate citologica a sputei;
• Raportul celule inflamatorii / celule malpighiene.

Bacterioscopia cantitativa Se selecteaza si se examineaza cu marire de 1000 x cat mai multe campuri bine etalate si corect diferentiate tinctorial, cu cel putin 3 celule inflamatorii si la distanta de cel putin 3 diametre, in orice directie, de celulele malpighiene. Pe asemenea campuri se determina numarul mediu de bacterii dintr-o categorie microscopica / camp :

• bacterii pneumococoide;
• bacterii hemofiloide;
• bacterii neisserioide;
• bacterii Gram negative sau Gram pozitive, etc.

Asocierea cu polimorfonuclearele a cel putin 10 bacterii din aceeasi categorie microscopica se considera asociere semnificativa clinic si are predilectie pozitiva de peste 0,9 pentru izolarea in sputocultura a unui patogen din aceeasi categorie microscopica de cel putin 10 6 UFC / ml.
Comunicarea asocierii semnificative a unei bacterii cu celule inflamatorii din sputa orienteaza rapid tratamentul antimicrobian al pacientilor pneumonici.
Atat in sputa, dar mai ales in fluidul de aspirat (spalatura) bronsic, un reper important, usor de identificat, sunt celule ciliate ale epiteliului respirator. Intr-un context inflamator, bacteriile asociate lor capata semnificatie clinica, chiar in prezenta unor celule malpighiene, care pot fi de contaminare orofaringiana, dar si de metaplaziere a epiteliului traheobronsic.
Bacterioscopia prelevatelor necontaminate Prezenta bacteriilor in frotiurile facute din exudatul pleural, aspiratul pulmonar transtoracic sau din probele biopsice este semnificativa ca atare, fara a fi necesare relatii cantitative. Examinarea frotiului colorat cu metoda May - Grnwald Giemsa Pe acest frotiu se evalueaza detaliile citologice cu interes pentru microbiolog. Celulele expectorate pot fi impartite in celule inflamatorii si celule de exfoliere. Celule inflamatorii: Se determina procentul acestor celule in expectoratii.
Polimorfonuclearele neutrofile (PMN) 10 - 15 microni, sunt prezente in numar mare in inflamatii de natura infectioasa (bacteriana, virala), dupa agresiuni fizice si chimice ale mucoasei bronsice.Proportia lor poate ajunge pana la 90 % si pot fi intregi sau in diferite stadii de dezintegrare. Sunt frecvente in expectoratia astmaticilor , chiar in absenta infectiei.
Macrofagele si histiocitele 10 - 40 microni, sunt dupa PMN, cele mai frecvente celule in exudatele cailor respiratorii inferioare.Ele au citoplasma multa, nucleu unic oval, situat excentric sau doi sau mai multi nuclei.
Monocitele precursori ai macrofagelor si histiocitelor - au talie mica, nucleul invaginat si citoplasma relativ clara.
Eozinofilele - intr-o expectoratie proaspata, bine etalata, eozinofilele apar cu nucleul bi sau trilobat si cu granulatii mari, rosii. Cele prinse in trama de mucus au morfologia mai putin clara, nucleul micsorat iar granulatiile mai putin distincte, cu o nuanta spre albastru.
Prezenta lor trebuie interpretata prudent. In numar mic, ele apar in orice proces inflamator acut sau subacut.
La copilul mic, cand inflamatiile cronice ale tractusului respirator inferior determinaun proces alergic post infectios (bronsita astmatiforma), prezenta eozinofilelor pe fond de polinucleoza are valoare diagnostica deosebita. La pacientii cu bronsita cronica pot reprezenta pana la 5 % din celulele expectorate, iar la cei cu astm bronsic, 20 90 % .
Limfocitele au nucleul mare si citoplasma redusa si sunt destuld e putine in expectoratii. Numarul lor creste in bronsitele cronice si in tuberculoza pulmonara.
Celulele de exfoliere a epiteliului respirator Celulele cilindrice ciliate : corp alungit, au polul bazal ingustat si cel apical cu platou de cili scurti, observati la o marire puternica. Nucleul oval este situat parabazal. Exfoliaza frecvent in bronsita cronica (pana la 20 % din totalul celulelor exfoliate ), ca celule izolate, intacte sau degenerate. In astmul bronsic apar sub forma de mase celulare creola bodies. In infectiile cu Mycoplasma pneumoniae si in viroze respiratorii, in special gripa, se exfoliaza celule degenerate , fara cili (ciliocitophtoria).
Celulele bazale sunt mici cu citoplasma redusa; la o examinare superficiala se pot confunda cu limfocitele, dar spre deosebire de acestea ele au nucleul cu structura cromatiana mai putin densa.
Exfoliaza in numar mare in toate procesele de iritare bronsica. In sputa bronsiticilor cronici, celulele bazale constituie pana la 67 77 % din totalul celuleor bronsice exfoliate.
Celulele metaplazice Celulele metaplazice sunt elementele heterotope a caror interpretare depaseste cadrul microscopiei uzuale a sputei. Se pot gasi izolate sau in placarde. Cea mai frecventa heterotopie este metaplazia epiteliului bronsic in epiteliu malpighian. Apare frecvent in pneumopatii cronice inflamatorii (bronsita cronica, bronsiectazie, abcese pulmonare, tuberculoza ) dar poate fi si neoplazica.
Interpretarea citologiei exfoliative cere experienta citologica. Examinarea culturilor dezvoltate pe mediile inoculate, identificarea izolatelor si comunicarea rezultatelor. Dupa perioada de incubare se examineaza culturile dezvoltate, iar in cazul determinarilor cantitative se numara si se calculeaza UFC / ml.
Pentru identificarea izolatelor, 5 colonii caracteristice se trec pe medii adecvate , neselective, iar cultura obtinuta se supune testelor de identificare specifice fiecarei categorii de bacterii. Nivelul pana la care se face identificarea izolatelor care intrunesc un minim de criterii cu semnificatia clinica depinde de:

• contextul clinic al pacientului
• confruntarea dintre subcultura si citobacterioscopia cantitativa.

Identificarea comensalilor rezidenti ai orofaringelui (streptococii viridans, corinebacteriile, neisseriile nepretentioase, stafilococii caguleaza negativi, Candida spp., se opreste la nivel de grup ). Izolatele asociate semnificativ cu leucocitele pe frotiul facut direct din sputa trebuie identificate pana la nivel de specie. Streptococii Streptococii a-hemolitici trebuie diferentiati in pneumococi cu semnificatie clinica posibila si in streptococi viridans, fara semnificatie clinica. Sensibilitatea la bacitracina ramane numai un test prezumtiv de diferentiere a streptococilor din grupa A si cei apartinand altor grupe. Semnificatia grupelor se face cu trusa de reactivi STREPTIC. Streptococii nehemolitici se inregistreaza ca atare, nu se identifica si nu se comunica. Haemophilus spp. Izolatele de Haemophilus trebuie identificate pana la nivel de specie pe baza criteriilor din tabelul 3 si prin reactia de seroaglutinare. Enterobacterii Enterobacteriile pot cauza infectiiale tractusului inferior la persoanele imunocompromise. In conditii de spitalizare pot fi implicate in asemenea infectii, in afara de K. pneumoniae si alte specii de enterobacterii, mai ales unele tulpini hemolitice de E. coli. Identificarea lor este necesara numai in situatii clinico-epidemiologice sugestive si cand citobacterioscopia cantitativa atesta asocierea semnificativa a bacililor Gram negativi cu leucocitele. Neisserii Caracterele morfologice cercetate microscopic, cele culturale si reactia oxidazei pozitiva le identifica la nivel de gen. Daca citobacterioscopia atesta semnificatia clinica a acestor izolate, ele se testeaza pe mediu Thayer Martin modificat pentru a diferentia meningococii de Moraxella catharalis. Coloniile alb cenusii, friabile si intens oxidazo- pozitive se apreciaza a fi Moraxella catharalis. Bacili Gram negativi nefermentativi Dintre acestia semnificatia clinica cea mai mare o prezinta P. aeruginosa care se identifica pe baza caracterelor culturale , pigmentogenzei si capacitatii de a se dezvolta la 42 0 C. Stafilococi Se identifica numai S. aureus, restul se inregistreaza numai ca stafilococi coaguleaza negativi, fara a-i comunica. Semnificatia clinica a S. aureus trebuie argumentata prudent la pacientii aflati sub terapie antimcrobiana. Bacili Gram pozitivi Prezenta bacililor corineformi in sputa poate sugera o infectie cu Rhodococcus equi. Desi au fost semnalate cazuri de infectii pulmonare cu B. cereus si B. subtilis, totusi semnificatia clinica cea mai mare o prezinta B. anthracis care se identifica pe baza aspectului morfologic, capsulogenezei detectabila in materialele patologice si in mediile agarizate cu adaos de ser sau sange,a lipsei hemolizei si a prezentei sensibilitatii la penicilina.
In legatura cu interpretarea rezultatelor culturilor din sputa trebuie retinute urmatoarele doua aspecte:

• Examenul microbiologic al sputei reprezinta singurul mijloc de diagnostic etiologic in toate sindroamele pulmonare. Rezultatul acestui examen depinde in mare masura de respectarea conditiilor de recoltare, transport si prelucrare corecta. Cand aceste operatiuni nu se efectueaza corect, rezultatele examenului pot fi false.
• Foarte frecvent sputa se contamineaza cu flora buco- faringiana, asa incat este foarte dificil de precizat, care din germenul potential patogen este agentul etiologic adevarat. Astfel, culturile pozitive cu neisserii nepatogene, stafilococi albi, streptococi viridans, pseudodifterici sunt aproape cu siguranta rezultatul contaminarii sputei cu microflora buco- faringiana.
• O buna corespondenta intre examenul citobacterioscopic si cel cultural, mai ales in cadrul dezvoltarii unei culturi quasi monomorfe cu germeni intalniti frecvent in infectiile arborelui respirator (S. pneumoniae, H. influenzae, streptococi b - hemolitici, Klebsiella, S. aureus), cu existenta unui suport citologic corespunzator ( celule epiteliale de origine bronsica sau alveolara, leococite polinucleare integre sau degradate), constituie elementele unui rezultat fidel.

In eventualitatea unui rezultat pozitiv fidel al culturilor, este necesara efectuarea antibiogramei. Se contraindica efectuarea antibiogramei la flora totala a unei spute.
Informatii specifice Focus ParametruValori normaleUM Examen sputa - cultura Examen sputa - antiiograma