Descriere Diagnosticul si monitorizarea multor boli hematologice depinde de examinarea maduvei osoase, in special in conditiile in care procesul patologic are originea in maduva. De multe ori studiul citologic al maduvei trebuie corelat cu examenul histologic al biopsiei osteo-medulare care aduce informatii suplimentare cantitative si arhitecturale. De asemenea, in  unele cazuri, examenul maduvei osoase este completat cu efectuarea de coloratii specifice necesare pentru evaluarea depozitelor de fier (coloratia Perls/cu albastru de Prusia), diagnosticul diferential al leucemiilor acute (coloratii citochimice pentru mieloperoxidaza, esteraze nespecifice, PAS), diagnosticul lipidozelor (coloratia PAS in boala Gaucher) sau cu studii citogenetice sau moleculare.

Frotiul medular este evaluat conform urmatoarelor criterii:

I. Celularitate: se apreciaza cel mai bine la nivelul zonei intermediare si se descriu urmatoarele aspecte:
1) maduva normocelulara;
2) maduva hipercelulara (cu numar mare de grunji si celularitate densa; maduva poate fi hipercelulara prin implicarea celulelor non-hematopoietice, iar hematopoieza sa fie de fapt redusa);
3) maduva hipocelulara (cu grunji rari/absenti).
Maduvele real hipocelulare reprezinta o conditie rara (hipoplazia/aplazia medulara). Astfel o maduva hipocelulara se poate datora unor defecte de tehnica (aspirarea de sange din sinusurile medulare), depinde de cantitatea de maduva extrasa (cu cat se aspira o cantitate mai mare de maduva contaminarea cu sange este mai mare) sau poate aparea in cazul in care maduva este compacta si celulele nu se desprind la aspiratie (unele leucemii acute) sau in prezenta mielofibrozei care impiedica aspirarea celulelor (metaplazie mieloida cu mielofibroza, mielofibroza secundara, hairy cell leukemia). Presupunerea unei reduceri reale a celularitatii medulare se bazeaza pe detectia neechivoca a unor piese medulare asociate cu grasime si celule stromale. Pacientii varstnici pot prezenta arii crescute de grasime. Specimenele contaminate cu sange contin multe eritrocite mature si putine elemente nucleate. Informatiile cele mai valoroase asupra celularitatii medulare sunt obtinute pe baza examenului histologic al biopsiei osteomedulare in care raportul intre spatiile grase si tesutul hematopoietic este de 1-2/1 la adultul normal, iar o maduva real hipocelulara este considerata cand apare o reducere a celularitatii <25%.

II. Eritropoieza: Cel mai putin matur precursor eritroid care poate fi identificat in maduva este proeritroblastul (pronormoblastul), iar urmatoarele stadii de maturatie sunt reprezentate de eritroblastul (normoblastul) bazofil, eritroblastul (normoblastul) policromatofil si eritroblastul (normoblastul) ortocromatofil. Seria rosie este apreciata din punct de vedere cantitativ si calitativ.
Raportul granulo-eritroblastic (G/E) reprezinta raportul intre granulocitele neutrofile + precursorii lor si precursorii eritroizi si este de 2-4/1 la adultul normal, iar scaderea acestui raport se întalneste in hiperplazia eritroida (numar crescut de precursori eritroizi medulari) care insoteste diferite tipuri de anemii (anemie feripriva, anemie megaloblastica, anemie sideroblastica, talasemie). Raportul este marcat scazut/inversat in anemiile regenerative (posthemoragica/hemolitica). Cresterea raportului G/E indica fie hiperplazia seriei granulocitare, fie eritroblastopenie.
Predominanta formelor policromatofile (~50%) si ortocromatofile (>30%) indica o maturatie normala a seriei rosii. Cresterea formelor bazofile (>20%) indica deficit de hemoglobinizare (anemia feripriva) sau apare in anemiile megaloblastice severe.

III. Granulopoieza: Precursorii granulocitari care pot fi identificati  in maduva osoasa sunt mieloblastul, promielocitul, mielocitul neutrofil/eozinofil/bazofil si metamielocitul, care se gasesc alaturi de formele mature nesegmentate si segmentate neutrofile/eozinofile/bazofile. Celulele mieloide constituie elementul predominant din maduva, celulele mature fiind cele mai numeroase. Un numar crescut de celule imature indica de obicei un proces patologic.

IV. Megakariopoieza: megakarioblastii nu pot fi de obicei recunoscuti cu usurinta pe frotiul medular; se pot identifica megakariocitele bazofile (10-15% din numsrul total), megakariocitele granulare (60-70%) si megakariocitele trombocitogene (10-20%). Megakariocitele sunt celule foarte mari (30-150 µm), poliploide (8N, 16N, 32N etc.). Megakariocitele bazofile au citoplasma intens bazofila (numar crescut de ribozomi) indiferent de gradul de ploidie, iar nucleul este sferic, cu aspect tanar. Megakariocitele granulare au citoplasma rosie ca vinul datorita granulatiilor, iar nucleul este neregulat, cu numar variabil de lobi. Megakariocitele trombocitogene prezinta gruparea granulatiilor in viitoarele trombocite, trombocite adiacente la periferia lor, iar nucleul este mai mic si mai dens. Megakariocitele constituie tipul celular cel mai putin abundent din maduva, de obicei <1%.

V. Limfocitele prezente in maduva sunt de obicei limfocite mici. Limfocitele si plasmocitele sunt celulele cele mai neuniform distribuite din maduva, limfocitele fiind dispuse uneori in noduli, iar plasmocitele in mansoane, perivascular. Limfocitele sunt crescute in limfocitozele reactive si sindroamele limfoproliferative.   Uneori pot fi intalnite in maduva normala plasmocite binucleate. Plasmocitele sunt crescute in plasmocitozele reactive, cand pot fi prezente plasmocite cu citoplasma flambata, cu corpi Russell sau cu cristale intracitoplasmatice si in mielomul multiplu. In mielomul multiplu plasmocitele anormale prolifereaza in plin parenchim medular printre celelalte celule hematopoietice, spre deosebire de plasmocitozele reactive in care sunt dispuse perivascular. Plasmocitele mielomatoase pot prezenta un spectru larg de aspecte ale citoplasmei si nucleului si grade diferite de maturitate, uneori chiar in acelasi specimen de maduva. Acestea au de obicei mai multa citoplasma decat plasmocitele normale, mai deschis colorata, frecvent cu vacuole, uneori cu granulatii rosii, nucleul rotund poate fi localizat mai central decat in plasmocitul normal, cromatina este de obicei mai putin condensata, frecvent cu nucleol vizibil, ocazional foarte mare, bizar/chiar doi nucleoli; in mielom sunt crescute plasmocitele binucleate sau cu mai multi nuclei, celulele flambate si plasmocitele cu corpi Russell.

VI. Monocitele din maduva sunt identice cu cele din sangele periferic. Macrofagele (histiocitele) medulare sunt celule mari, cu raport nucleu-citoplasma scazut, citoplasma cu contur neregulat, de culoare gri, cu numeroase granulatii mici rosu-purpurii si granulatii azurofile mai mari, numar variabil de particule ingerate (celule intregi/distruse, nuclei, granule de hemosiderina etc.) si vacuole, majoritatea la periferia celulei reflectand pinocitoza; nucleul este mic, oval, de obicei unic, dar poate fi multiplu, localizat excentric, cu cromatina uniform distribuita, cu cel putin un nucleol evident; histiocitele active au cromatina mai condensata.

VII. Celulele non-hematopoietice care pot fi uneori observate pe frotiurile de maduva sunt: adipocite (in hipoplazia/aplazia medulara), celule stromale, celule reticulare, osteoblasti si osteoclasti (in special la copii si în maduva fetala osteoblastii trebuie diferentiati de plasmocite, iar osteoclastii de megakariocite sau de metastazele medulare), mastocite (in hipo-/aplazie medulara, limfoame, leucemie limfocitara cronica, boli infectioase, mastocitoza sistemica). In mod normal aceste celule reprezinta <1% din celularitatea medulara.

VIII. Celulele atipice: pot fi reprezentate de celule blastice, celule mielomatoase, limfomatoase sau celule carcinomatoase.

Recomandari Recomandari pentru efectuarea medulogramei:

- diagnosticul anemiei megaloblastice;
- diagnosticul mielomului multiplu;
- diagnosticul lipidozelor: boala Gaucher, boala Niemann-Pick, sindromul histiocitelor albastre ca marea;
- investigarea unei citopenii fara o cauza aparenta, pentru confirmarea/infirmarea unei leucemii, sindrom mielodisplazic, hipo-/aplazie medulara, agranulocitoza;
- diagnosticul, clasificarea si monitorizarea leucemiilor acute;
- diagnosticul si monitorizarea sindroamelor mielodisplazice;
- in leucemia mieloida cronica, pentru examen citogenetic si pentru diagnosticul de faza accelerata sau puseu blastic;
- rar in investigarea unei anemii microcitare hipocrome, pentru diferentierea anemiei feriprive de anemia din bolile cronice, prin cercetarea depozitelor de fier (hemosiderinei) medulare;
- diagnosticul bolii Waldenström;
- in anemiile hemolitice pentru diagnosticul crizelor aplastice.

Pregatire pacient Se recolteaza a jeun (pe nemancate) sau postprandial. Se foloseste anestezia locala pana la periost la locul de punctionare, eventual premedicatie cu tranchilizante la pacientii sensibili.

Metoda Se utilizeaza examinarea microscopica initial la putere mica (obiectivul de 10x/20x) pentru aprecierea calitatii frotiului (prezenta de grunji, calitatea coloratiei, prezenta de artefacte), celularitatii si prezentei megakariocitelor; de asemenea celulele tumorale si granuloamele pot fi observate prin scanarea frotiului la putere mica. La examinarea cu obiectivul de putere mica frotiul medular cu grunji striviti colorat are o zona centrala de culoare inchisa reprezentata de grunjul medular, care contine celule stromale, adipocite, granulocite si multe celule distruse (nuclei liberi) si suprapuse, o zona periferica ce contine celule medulare diluate cu sange (ca si frotiurile subtiri efectuate prin intindere) si unde pot fi examinate detaliile morfologice ale celulelor izolate si o zona intermediara cu celularitate bogata, saraca in celule sanguine si celule adipoase si in care celulele medulare apar izolate sau grupate in insule/cuiburi si pastreaza intr-o oarecare masura relatiile arhitecturale din maduva; aceasta este zona care permite cel mai bine aprecierea semicantitativa a celularitatii medulare si evaluarea morfologica optima. Megakariocitele se gasesc de obicei la limita dintre zona centrala si zona intemediara. Apoi frotiul se examineaza cu obiectivul de 100x cu imersie; trebuie evaluate minim 500 celule nucleate intacte, excluzandu-se nucleii liberi. Numaratoarea se efectueaza intr-o arie unde sunt prezenti putini nuclei liberi, celulele nu se suprapun, nu sunt grupate sau distorsionate. Aceasta este de obicei situata in zona celulelor dispersate adiacenta zonei centrale. De notat ca grunjii pot fi absenti in maduvele pediatrice si maduva va aparea ca o dispersie uniforma de celule.

Pentru cadre medicale

Specimen recoltat - aspiratul medular este obtinut de preferinta prin punctia osului iliac (spina iliaca postero-superioara), care este lipsita de incidente majore si poate fi asociata cu efectuarea biopsiei osoase; se pot efectua de asemenea punctia sternala la nivelul spatiului II intercostal (ce poate fi grevata insa de incidente majore, cum ar fi tamponada cardiaca si decesul pacientului) sau punctia spinei iliace antero-superioare/proceselor vertebrale spinoase in conditiile in care pacientul nu poate fi pozitionat pentru punctia spinei iliace postero-superioare sau zona respectiva este afectata prin iradiere/chirurgie anterioare. La copii maduva osoasa se poate obtine prin punctia ariei tibiale antero-mediale.

Recipient de recoltare - maduva este aspirata cu o seringa de plastic de 10-20 mL fara anticoagulant.

Cantitate recoltata - 0.2-2 mL.

Cauze de respingere a probei - frotiuri incorect efectuate/colorate.

Prelucrare necesara dupa recoltare - din materialul aspirat se efectueaza rapid, inainte ca proba sa coaguleze, mai multe frotiuri. Se pot efectua frotiuri subtiri prin intindere, intr-un mod asemanator cu frotiurile de sange si/sau frotiuri cu grunji striviti (se dispune pe o lama de sticla o portiune din materialul medular care contine grunji, iar deasupra lui se aseaza o alta lama/lamela cu care acesta este tras spre capatul lamei), acestea din urma fiind preferate pentru examenul citologic al maduvei osoase, permitand totodata si o apreciere semicantitativa a celularitatii medulare. Se recomanda efectuarea a minim cinci frotiuri de maduva. Frotiurile se usuca in aer 30 minute; pentru examinarea morfologica a elementelor celulare si numararea acestora se coloreaza May-Grunwald-Giemsa; o parte din lame sunt pastrate necolorate pentru posibile coloratii speciale.

Stabilitate proba - frotiurile fixate in metanol sunt stabile necolorate cel putin 1 an fara scaderea calitatii.

Limite si interferente 1. Variatii fiziologice: la copii limfocitele sunt mai numeroase in maduva, in special la copiii pana la 4 ani unde pot constitui pana la 40% din celularitatea medulara; plasmocitele sunt rare la copii. In prima luna de viata celulele eritroide sunt proeminente datorita nivelurilor crescute de eritropoietina. De asemenea copiii tind sa aiba un numar mai mare de eozinofile si precursori eozinofilici.
2. Evaluarea aspiratului medular ofera putine informatii privind celularitatea totala a maduvei osoase datorita fluctuatiilor in numararea elementelor celulare indusa de contaminarea cu sange periferic a specimenului medular. Evaluarea mai precisa a celularitatii medulare necesita examinarea histologica a biopsiei osteomedulare.
3.  Multe medicamente determina cresterea numarului de eozinofile medulare.
4.  O maduva normala/non-diagnostica nu exclude posibilitatea unei boli localizate intr-o alta zona a maduvei.
5. Limite care tin de coloratie:
- celulele sunt colorate excesiv in albastru: timp prea lung de colorare, buffer prea alcalin (incorect preparat/vechi), frotiuri vechi/frotiuri prea groase. Coloratia poate fi imbunatatita prin spalarea rapida si intensa cu apa distilata.
- aria dintre celule este colorata: spalare inadecvata a lamei, sange recoltat pe heparina/posibila paraproteinemie.
- coloratia apare prea roz/rosie: buffer prea acid, timp prea scurt de colorare/spalare excesiva a lamei.
6. Limite care tin de tehnica de efectuare a frotiului:
- distributie anormala a leucocitelor, cu dispunerea leucocitelor de dimensiuni mari pe marginile frotiului si in franjuri. De asemenea leucocitele de pe margini pot aparea mai mici decat in mod normal (contractate)/rupte. In particular celulele neoplazice se pot rupe datorita presiunii mecanice excesive. Exista variatii mari statistice ale formulei leucocitare manuale in special daca este efectuata numaratoarea pe 100 de celule si in prezenta leucopeniei.
7. Artefacte determinate de EDTA, in special in probele vechi:
- artefacte ale eritrocitelor: hematii crenelate, hematii in tinta, stomatocite;
- trombocitele pot aparea marite, mai slab colorate si fara granulatiile azurofile caracteristice;
- artefacte ale leucocitelor: vacuolizari/rupturi citoplasmatice, kariorexis nuclear. Monocitele apar cu numeroase vacuole si/sau nucleu neregulat lobulat;
- limfocitele reactive continua sa se modifice morfologic pe masura ce stau in probele cu EDTA, nucleul devenind convolut, iar citoplasma largita si/sau vacuolata (ar putea fi confundate cu celulele limfomatoase);
- nucleul limfoplasmocitelor poate deveni convolut/in forma de frunza de trifoi.