Descriere

Meningitele bacteriene sunt boli acute severe care, datorita sechelelor neuro-psihice si mortalitatii crescute, reprezinta o urgenta maxima atat pentru clinician, cat si pentru personalul laboratorului de microbiologie clinica.
Lichidul cefalorahidian apare ca secretie a plexurilor coroide din ventriculii cerebrali si prin difuziune  libera din tesutul nervos. Format in ventriculii cerebrali, LCR trece in spatiul subarahnoidian prin trei foramene ale ventriculului IV. Resorbtia LCR prin vilii si granulatiile arahnoidiene este in echilibru cu secretia.
Rolul fiziologic al LCR este de protectie biomecanica (amortizare si mentinere a formelor anatomice proprii SNC) si biodinamica (eliminarea surplusului de lichid interstitial, mentinerea homeostaziei mediului in care functioneaza neuronii). Barierele hematomeningee si hematoencefalica reduc accesul agentilor infectiosi, al metabolitilor toxici, dar si al chimioterapicelor catre LCR si tesutul nervos.

Infectarea SNC se poate produce:
1. Hematogen, in cursul unor bacteriemii (cand se depasesc 104 UFC/ ml sange) sau viremii cu diferite porti de intrare;
2. Prin contiguitate, din focare infectioase juxtameningiene: otite medii acute, sinuzite, mastoidite;
3. Din exterior, dupa fracturi craniene (meningite traumatice cu cel mai variat spectru etiologic), punctii        rahidiene sau interventii chirurgicale pe nevrax (meningite iatrogene, eventual cu tulpini bacteriene de spital) si la pacienti cu anomalii congenitale (meningocel s.a.).
4. Rar pe cale intraneurala: virusul rabic prin nervii senzitivi periferici, ocazional virusul Herpes simplex prin radacinile nervului trigemen sau ale nervilor sacrati.

Infectiile SNC pot evolua ca:
- Meningite purulente cauzate cel mai frecvent de bacterii;
- Meningite cu lichid clar si evolutie acuta: sunt determinate mai frecvent de virusuri, uneori de leptospire. Ocazional au variate alte cauze (chimice, fizice, alergice, neoplazii, focare supurative parameningeale);
- Meningite cu lichid clar si evolutie cronica: posibila etiologia tuberculoasa, sifilitica sau fungica;
- Encefalite si meningoencefalite mai frecvent de etiologie virala;
- Abcese cerebrale.

Etiologia infectioasa a meningitelor si meningoencefalitelor este variata:
- Virusuri: enterovirusuri, paramixovirusuri, adenovirusuri;
- Bacterii: N. meningitidis, Str. pneumoniae, Str. agalactiae, H. influenzae, S. aureus, L.monocitogenes, M. tuberculosis si rar Enterobacteriaceae, Spirochete;
- Fungi: Candida albicans, Cryptococcus neoformans;
- Paraziti: Toxoplasma gondii, Naegleria fowleri, Plasmodium spp.

Examinarea bacteriologica a LCR
Examenul macroscopic evidentiaza transparenta, culoarea si fluiditatea. LCR-ul normal are transparenta, fluiditatea si claritatea “apei de stanca”, fiind incolor.
In functie de patologie pot sa apara urmatoarele aspecte: rosu opalescent  in hemoragii meningiene prin boala de fond sau rosu transparent prin accident de punctie, aspect “lacat”, in hemoragii meningiene mai vechi sau xantocrom (cu diferite nuante de galben) datorita methemoglobinei sau bilirubinei.

Caracteristicile LCR normal si modificarile microbiologice, citologice si biochimice ale LCR in meningite sunt evidentiate mai jos:
1. LCR normal:
- aspect - clar, incolor;
- examen microbiologic - steril;
- examen citologic - 0-3 limfocite/mm3;
- examen biochimic - proteine=15-40 mg/dl; glucoza=50-70 mg/dl; acid lactic=35 mg/dl; cloruri=680-730 mg/dl.
2. Meningita bacteriana acuta:
- aspect - opalescent, purulent;
- examen microbiologic - depistare rapida microscopica si antigenica; izolare;
- examen citologic - PMN> 1000/mm3;
- examen biochimic - proteine=>100 mg/dl; glucoza=<40 mg/dl; acid lactic=>35 mg/dl.
3. Meningita TBC:
- aspect - clar sau usor opalescent, cu val de fibrina;
- examen microbiologic - depistare rapida, izolare;
- examen citologic - limfocite in jur de 200/mm3;
- examen biochimic - proteine=>100 mg/dl; glucoza=<40 mg/dl; acid lactic=>35 mg/dl; cloruri=<600 mg/dl.
4. Meningita micotica:
- aspect - clar sau opalescent;
- examen microbiologic - depistare rapida microscopica si antigenica; izolare;
- examen citologic - predomina limfocitele 100-500/mm3;
- examen biochimic - proteine=>100 mg/dl; glucoza=<40 mg/dl; alcool etilic prezent.
5. Meningita virala:
- aspect - clar sau opalescent;
- examen microbiologic - steril bacteriologic; se poate izola virusul;
- examen citologic - limfocite 500-1000/mm3;
- examen biochimic - proteine=15-100 mg/dl; glucoza=50-70 mg/dl; acid lactic=35 mg/dl; cloruri=680-730 mg/dl.

Examenul citologic  - consta in numararea elementelor in suspensie si determinarea tipului de celule din sediment. Numararea elementelor in suspensie se face pe lichidul necentrifugat si se exprima in numar de elemente pe mm3. Numaratoarea se efectueaza cel mai frecvent in camera Fuchs-Rosenthal.
In acest scop, o cantitate din LCR-ul bine omogenizat se introduce intr-o alta eprubeta pentru a se evita contaminarea ulterioara.
In functie de aspectul macroscopic al lichidului se procedeaza astfel:
- LCR clar sau opalin –se preleva aseptic cu pipeta Pasteur o cantitate mica de lichid suficienta pentru a umple camera de numarat Fuchs-Rosenthal;
- LCR hemoragic – se adauga acid acetic glacial in proportie de o picatura la zece picaturi de LCR; se asteapta 1-2 minute pentru liza hematiilor, apoi cu pipeta Pasteur se umple camera de numarat;
- LCR tulbure, purulent -  se face o dilutie de 1/10 sau eventual 1/100 in ser fiziologic. In acest caz, numarul de celule obtinut va fi inmultit cu 10 sau 100 in functie de dilutia folosita.
Camera Fuchs-Rosenthal are o suprafata de 16 mm2, o inaltime de 0.2 mm si un volum de 3.2 mm2.
1. Daca densitatea celulelor este mica se face numaratoarea pe toate cele 16 patrate ale camerei si se imparte suma la 3 pentru a afla numarul celulelor pe mm3.
2. Daca densitatea celulara este mai mare se numara 5 patrate mari delimitate de linii triple, aceasta valoare reprezentand numarul de celule pe mm3.
Concomitent cu numaratoarea de elemente in camera de numarat, cantitatea de LCR ramasa in tubul primar primit la laborator se centrifugheaza 15-20 minute la 3000 rotatii/min, pentru determinarile ulterioare.
Dupa centrifugare supernatantul este colectat intr-un tub steril si folosit pentru decelarea de antigene solubile, iar sedimentul este folosit pentru frotiuri si culturi bacteriene.
Pentru realizarea frotiurilor se folosesc lame curate, degresate, de preferinta noi, pentru a avea siguranta ca nu au bacterii restante de la examinari anterioare. Sedimentul se intinde cu ansa sau cu pipeta Pasteur pentru a obtine un strat  continuu de celule din centrul lamei spre periferie. Se prepara 4 frotiuri din care 2 vor fi fixate si colorate Gram si respectiv albastru de metilen, 1 frotiu va fi colorat May - Grunwald - Giemsa si unul va ramane de rezerva.
In cazul in care exista suspiciune de meningita cu Cryptococcus neoformans se executa un preparat proaspat intre lama si lamela din sediment cu tus India. Prezenta de formatiuni rotund ovalare, capsulate (halou mare, clar si incolor) care pot fi inmugurite este sugestiva pentru Cryptococcus neoformans.
Pe frotiul colorat Gram se evidentiaza prezenta germenilor, morfologia, tinctorialitatea, frecventa si localizarea (intra sau extraleucocitari).
Lamele colorate May-Grunwald-Giemsa si albastru de metilen se utilizeaza pentru examenul citologic. Se apreciaza procentual tipul elementelor: PMN, limfocite, notandu-se in acelasi timp aspectul lor.
Cultivarea este un mijloc de diagnostic specific, dar necesita 24 - 48 de ore si poate fi negativa in cazul prezentei germenilor neviabili sau daca pacientul a inceput tratamentul antibiotic.
Insamantarea sedimentului se efectueaza pe placi preincalzite la termostat.
Se vor folosi: agar Columbia cu 5% sange de berbec, agar chocolate, geloza lactozata si bulion thioglycolat. In functie de examenul bacterioscopic, pot fi adaugate si alte medii (Sabouraud). Mediile sunt incubate la 37°C, eventual in atmosfera cu 5% CO2 pentru medii ca agar Columbia cu 5% sange de berbec si agar chocolate.
Aparitia culturii este urmarita zilnic timp de 3 zile pe mediile solide si 5 zile in tubul cu bulion thioglycolat. In cazul culturilor pozitive se continua identificarea pana la nivel de specie si efectuarea antibiogramei.
Daca bacterioscopia atesta prezenta unei mari densitati bacteriene in proba de LCR (zeci de bacterii pe camp microscopic examinat cu marire de 1000x), se poate incerca antibiograma din cultura primara, ale carei rezultate urmeaza a fi confirmate prin antibiograma pe subcultura standardizata.
Avand in vedere limitele examenului microscopic si a culturilor, s-au pus la punct metode de detectare a antigenelor solubile in LCR: CIE, Latex-aglutinare, Coaglutinare, ELISA si RIA.
In cadrul laboratoarelor Synevo, pentru detectarea antigenelor solubile se foloseste ca test rapid reactia de latex-aglutinare. Tehnica de lucru este conform foii de kit.
Un rezultat negativ nu exclude posibilitatea infectiei cu germenul testat deoarece antigenele bacteriene pot fi prezente in concentratie mai mica decat limita de detectie a reactivilor utilizati.
Un rezultat pozitiv trebuie, de asemenea, urmat de izolarea germenului, identificarea si testarea sensibilitatii la antibiotice.
Examenul citologic, bacterioscopia si latex-aglutinarea permit microbiologului eliberarea unui rezultat partial, necesar clinicianului in orientarea tratamentului de prima intentie.

Pentru cadre medicale Prelevarea si transportul probelor
Prelevarea probelor de LCR este de competenta exclusiva a specialistilor infectionisti, neurologi sau neurochirurgi si se realizeaza prin  punctionarea spatiului subarahnoidian la nivel lombar, suboccipital si mai rar ventricular in conditii strict aseptice si de preferat inaintea administrarii de antibiotice.
Meningitele bacteriene “decapitate” prin tratament antimicrobian pot evolua cu lichid clar si creeaza adesea mari probleme de diagnostic.
Cantitatea de 5–10 mL LCR satisface necesitatile pentru examenele biochimice si microbiologice, iar fragmentarea probei inca de la recoltare in doua tuburi sterile minimalizeaza riscul contaminarii prin splitare ulterioara. Cand cantitatea recoltata este mai mica se va comunica laboratorului ce teste vor fi efectuate prioritar. Procesarea unei cantitati mult prea mici poate indica un rezultat fals negativ, acest lucru fiind mult mai daunator pentru pacient decat efectuarea unei noi punctii lombare.
In momentul recoltarii se pot face aprecieri asupra presiunii si aspectului lichidului.
Tuburile recoltate sunt etichetate la patul bolnavului si trimise la laborator impreuna cu cerea de analize solicitate care trebuie sa cuprinda: numele si prenumele pacientului, varsta, diagnosticul si daca este sub tratament antibiotic. Proba se transporta imediat la laborator fara a fi refrigerata sau termostatata.